В.И. Никитенко, Г.Н. Тукумбетова, М.Р. Исаев, В.А. Баталин

Актуальность. К настоящему времени в ряде исследований установлено, что одной из функций микрофлоры желудочно-кишечного тракта является участие в регуляции метаболизма желчных кислот и холестерина (ХС) (Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). S.E. Gilliland et al. (1990) показали, что у безмикробных животных, содержащихся на обогащенных ХС рационах, аккумулируется приблизительно в 2 раза больше ХС в крови, чем у животных с обычной микрофлорой. Последние экскретируют ХС в фекалии больше, чем безмикробные животные, и это дает основание полагать, что кишечная микрофлора препятствует его всасыванию из кишечника. Предполагается участие микроорганизмов (в частности - Lactobacillus fermentum) в процессах конъюгации//деконъюгации желчных кислот и образовании производных, имеющих более низкую степень кишечной реабсорбции, что приводит к снижению сывороточного уровня ХС (D.I.A Pereira et al., 2003). Аналогичную способность выявили у Bifidobacterium longum Grill J.P. et al. (1995). Модельный эксперимент на петухах, получавших обогащённую ХС диету показал, что у птиц, которым помимо этого давались пробиотики, уровень ХС в печени и сыворотке крови был достоверно ниже, чем в контрольной группе. При исследовании кишечной флоры у них выявлялось снижение количества высеваемых видов  Enterobacteria, в то время как количество видов Bacillus, Streptococcus, Bifidobacterium и Lactobacillus увеличивалось (Endo T., Nakano M., 1999). Влиянию двух последних микроорганизмов на липидный обмен в последние годы уделяется достаточно много внимания. Так, Tahri et al. (1996) при сравнительном исследовании Bifidobacterium breve и Lactobacillus amilovorus показали, что клетки обоих штаммов, растущие в питательной среде, содержащей бычью желчь или таурохолевую кислоту, способны удалять из неё ХС. Причём, для лактобацилл этот эффект был связан как с бактериальной ассимиляцией, так и с преципитацией. Для бифидобактерий оказалась характерной только преципитация (Grill J.P. et al., 2000). Возможным механизмам удаления ХС лактобациллами посвящены работы Liong M.T., Shah N.P. (2005), Dilmi-Bouras A. (2006) и Zhao J.R., Yang H. (2005). Причём в последней не только резюмируются полученные in vitro данные, но и оцениваются возможные механизмы гипохолестеринемического эффекта пробиотиков в организме человека.Кроме того, установлено, что один из вариантов нарушения кишечной микрофлоры - Small Intestinal Bacterial Overgrowth Syndrome (SIBOS), этио-патогенетическим смыслом которого является избыточный бактериальный рост анаэробов в тонкой кишке (развивающийся часто вследствие подавления аутохтонной микрофлоры), приводит к ранней деконъюгации связанных желчных кислот в тощей кишке и образованию их токсичных эндогенных солей, что увеличивает возврат в печень практически до 100% выделенных в просвет тонкой кишки желчных кислот (Fukushima K. et al. 1998). Это приводит к компенсаторному уменьшению по принципу «обратной связи» синтеза желчных кислот в гепатоцитах, вследствие чего повышается содержание ХС в плазме крови в связи с отсутствием необходимости восполнять ежедневные физиологические потери (фекальная экскреция) желчных кислот и ХС в нарушенном цикле энтерогепатической циркуляции. Возникающая одновременно с этим нехватка желчных кислот в толстой кишке приводит к прогрессированию дисбиотических нарушений, брожению, дисфункции баугиниевой заслонки и усилению микробной контаминации тонкой кишки с одной стороны, а с другой - к поступлению в кровь повышенного количества эндотоксина грамотрицательной микрофлоры для связывания которого используются первоначально антиатерогенные липопротеиды высокой плотности (ЛПВП) (Савельев В.С. и соавт., 2007). Однако, эти авторы считают, что само по себе «первичное» поражение печени и/или процессов желчевыделения (часто в результате холестероза желчного пузыря и его крайней формы - желчно-каменной болезни) приводит к снижению образования и выделения желчных кислот, а это в свою очередь, в отсутствии «стерилизующих свойств желчи» к избыточному бактериальному росту в тонкой кишке. Порочный круг, таким образом, замыкается.Следует отметить, что в последние годы отмечается тенденция к росту патологических состояний, сопровождающихся нарушением микроэкологического равновесия кишечника. На протяжении ряда лет ведётся поиск оптимальных средств, направленных на профилактику возникновения дисбактериоза и увеличивающих сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам внешней среды. С этой целью пытаются применять ферментированные с помощью бактерий кисломолочные продукты, которые в настоящее время являются важным компонентом питания людей. Однако, содержащиеся в этих продуктах микроорганизмы, как правило, не удаётся колонизировать в кишечнике. К сожалению, подобная участь, зачастую приготовлена и для части пробиотиков, представляющих собой штаммы «воспроизводящие» нормальную микрофлору толстой кишки (Киселёв С.А. и соавт., 2004; Маянский А.Н., 2000; Савельев В.С. и соавт., 2007). Это послужило основой для создания новой стратегии лечения дисбактериоза в которой основное место уделяется стимуляции развития собственной (эндогенной) микрофлоры и восстановлению симбиотического равновесия в системе «хозяин - микробиота».В этой связи особый интерес представляют собой препараты на основе бактерий рода Bacillus. Во-первых, они избирательно подавляют рост патогенной и условно-патогенной флоры, во-вторых, увеличивают количество сапрофитных микроорганизмов, в первую очередь - лактобацилл и бифидобактерий, одновременно регулируя популяцию лактозопозитивных кишечных палочек и подавляя рост лактозонегативных (Никитенко М.В., 2004; Hosoi T., Ametani A., 2000; Urao M., Fujimoto T., 1999). В-третьих, в отличие от большинства других микробов, они способны образовывать споры и, благодаря этому, поступая в пищеварительный канал даже в небольших количествах, сохраняют жизнеспособность под воздействием кислот, желчи и способны достигнуть дистальных отделов кишечника (Hyronimus B., Le Marrec C., 2000; Hoa T.A., Duc L.H., 2001; Jadamus, Vahje W., 2001). Одним из первых в клинической практике появился препарат "бактисубтил" или "флонивил". Он  с успехом используется для лечения дисбактериозов различной этиологии у взрослых и детей (Положенкова Л.А. и соавт., 1999).  В его состав входит живая культура Bacillus cereus. Однако, имеются данные о токсичности  некоторых штаммов этой бактерии (Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., 1998). Это и высокая потребность в новых препаратах послужили основанием для разработки других пробиотиков. В.И. Никитенко и И.К. Никитенко (1986) был создан препарат споробактерин, содержащий взвесь живых Bacillis subtilis 534. Он с 1992 года рекомендован МЗ РФ для использования в клинической практике для терапии дисбактериозов, кишечных инфекций, профилактики и лечения хирургической инфекции (Никитенко В.И. и соавт., 1996; Кудашев С.Г., 2000; Есипов Д.В., 2004; Никитенко М.В., 2004; Исаев С.Ж., 2005). Вышеизложенное дало нам основания применить споробактерин для коррекции дисбактериозов, ожидая при этом также и его позитивного влияния на показатели липидного обмена.

Цель работы. Оценить связь состояния микрофлоры кишечника с некоторыми показателями нарушений липидного обмена и возможность коррекции последних «Споробактерином».

Материалы и методы исследования. На первом этапе обследовано 38 пациентов (мужчин - 18, женщин - 20, средний возраст - 54,00±13,59 лет), попавших в случайную выборку из числа лиц, находившихся на лечении в гастроэнтерологическом отделении государственного учреждения здравоохранения «Оренбургская областная клиническая больница» (ГУЗ ООКБ) в 2007 г. Всем им проводилась оценка состояния просветной микрофлоры толстого кишечника и определение сывороточных уровней общего ХС, b-липопротеидов (b-ЛП) и ЛПВП.

В соответствии с методическими рекомендациями Н. М. Грачевой и соавт. (1986) забор фекалий проводили в стерильные пенициллиновые флаконы. Навеску 1 г испражнений тщательно растирали в стерильной ступке с 9 cм³ стерильного буферного раствора. Для выявления патогенных энтеробактерий из основного разведения (1:10) делали посев на обычно применяемые плотные среды (Плоскирева, Левина с синтомицином или другими антибиотиками, висмут-сульфит-агар). Одновременно делали массивный посев нативного материала на жидкие среды для обогащения (Мюллера, селенитовую, магниевую) с последующим высевом на плотные среды. Из основного разведения делали ряд последующих разведений в буферном растворе с 10 до 10^-12 и производили посев суспензии на соответствующие питательные среды. Все посевы инкубировали в термостате при 37^оС.

Для выделения грамположительных и грамотрицательных  анаэробных палочек, грамположительных и грамотрицательных анаэробных кокков производили посев по 0,05 см³ суспензии из разведений на поверхность следующих сред: Schaedler-агар с 5% бараньей крови; Schaedler-агар с 5% бараньей крови, канамицином и ванкомицином.

Спорообразующие анаэробы выделяли на Anaerobic-агаре посевом 0,05 см³ суспензии из разведений 10^-3-10^-5 и 10^-7. Молочнокислые палочки и кокки выделяли на MRS-агаре и LBS-агаре путем посева по 0, 05 см³ суспензии из разведений 10-10^-10. Все посевы инкубировали в анаэробных условиях в системе GasPak при 37^оС в течение 48-96 час. Энтерококки определяли при посеве 0,05 см³ суспензии из разведений 10^-3-10^-5; стафилококки - при посеве 0,05 см³ на желточно-солевой агар из разведений 10-10^-9. Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли на среде Сабуро с полимиксином. Посев производился из разведений 10-10^-8. Псевдомонады высевали из разведений 10^-1, 10^-3, 10^-5 посевом на малахитовый агар. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae определяли посевом 0,1 см³ суспензии фекалий из разведений 10^-5-10^-10 на среду Эндо, из разведения 10-10^-4 - на среду Плоскирева. Обязательно проводили весь объем исследований на выделение патогенных микроорганизмов семейства кишечных бактерий. Общее количество аэробных микроорганизмов и их гемолизирующие свойства определяли путем посева суспензии из разведений 10-10^-10 на 5% кровяной агар. Через сутки инкубации производили подсчет и микроскопию окрашенных по Граму мазков из различных колоний одного вида.

Идентификацию бактерий до уровня рода и вида проводили с использованием общепринятых методик и схем идентификации.

Количественное содержание всех видов микроорганизмов в 1 г фекалий определяли по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения: N=n · k · d,

где:

N - количество микроорганизмов в 1 г фекалий (КОЕ/г);

n - число колоний, выросших на питательной среде;

k - коэффициент посевной дозы (при посеве 1 см³ k=1, при посеве 0, 1 см³ k=10, при посеве 0, 05 см³ k=20);

d - степень разведения посевного материала.

Выделяли четыре степени дисбиоза кишечника (по Н.М. Грачёвой и соавт., 1986):

Дисбиоз I степени (компенсированная форма, латентная) характеризуется незначительными изменениями в аэробной части микробиоценоза (увеличение или уменьшение количества кишечной палочки). Бифидофлора и лактофлора не изменены (количество бифидобактерий > 10⁸ КОЕ/г).

Дисбиоз II степени (субкомпенсированная форма) - на фоне незначительного количественного снижения бифидобактерий (10⁷ КОЕ/г) выявляются количественные и качественные изменения кишечной палочки или других условно-патогенных микроорганизмов.

Дисбиоз III степени - значительно сниженный уровень бифидофлоры (10⁵-10⁷ КОЕ/г) в сочетании со снижением лактофлоры, резким изменением уровня кишечных палочек и появлением вирулентных свойств у условно-патогенных микроорганизмов.

Дисбиоз IV степени - отсутствие бифидофлоры, значительное уменьшение лактофлоры и изменение количества кишечной палочки (снижение или увеличение), возрастание как облигатных, так и факультативных и не характерных для здорового человека видов условно-патогенных микроорганизмов в ассоциациях.

 Определение сывороточных уровней общего ХС, ЛПВП и b-ЛП выполнялась на биохимическом анализаторе «Cobas Integra - 400» фирмы «Roche». Оценка лабораторных показателей проводилась по принятым для данных наборов референтым интервалам значений.

На втором этапе, 15 пациентам имеющим различные нарушения микробиоценоза кишечника (7 пациентов с дисбактериозом III и IV степени, и 8 с дисбактериозом I и II степени) и повышенный уровень общего ХС, при отсутствии коррекции дислипидемии статинами или другими препаратами и методами проведена коррекция дисбактериоза препаратом «Споробактерин жидкий, суспензия для приёма внутрь». Лечение начиналось в стационаре, а завершалось амбулаторно. Схема приёма споробактерина соответствовала утверждённой за №01-11/44-08 от 30.03.2006 г. инструкции по применению вышеуказанного препарата в течение 20 суток по 1 мл два раза в день за 30-40 минут до приёма пищи, разводя назначенную дозу в 15 мл остуженной кипячёной воды. Через 10 дней после проведенного курса проводили повторное бактериологическое исследование кала по вышеописанным методикам и определение уровней общего ХС, ЛПВП и b-ЛП. Кроме этого, всем этим пациентам дважды (до и после исследования) проводили исследование концентраций билирубина, активности аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, щелочной фосфотазы, гамма-глутамилтранспептидазы.

Статистическая обработка результатов исследования проводились на ПЭВМ Pentium-II. Использовались методы вариационной статистики с определением достоверности с помощью парного варианта критерия Стьюдента (Гланц С., 1999). Также оценивалась корреляция показателей состава кишечной микрофлоры с сывороточными уровнями общего ХС и b-ЛП с расчётом коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Гланц С., 1999).

Результаты исследования и их обсуждение. На первом этапе исследования дисбактериоз I степени был выявлен у 18 пациентов (47,37%), II степени - у 8 (21,05%), III степени у 3 (7,89%), IV степени - у 7 (18,42%). У двоих пациентов (5,26%) дисбактериоза не выявлено. Избыточный/сплошной рост кишечной палочки был выявлен у 25 пациентов (65,79%), снижение/отсутствие роста - у 11 (28,95%).

Статистически значимых связей между степенью дисбактериоза и изменениями как липидных фракций крови, так и других исследуемых биохимических показателей выявлено не было, однако, таковые были обнаружены при более детальном рассмотрении количественных и качественных изменений роста отдельных микроорганизмов. Так, была выявлена статистически значимая прямая связь между снижением/отсутствием роста лактобактерий и уровнем b-ЛП сыворотки крови (r=0,34; p<0,05). Уровень общего ХС сыворотки, равно как и число лиц с повышенным его содержанием (ХС>5,0 ммоль/л) показали тенденцию к связи со снижением роста лактобактерий, не достигшую уровня статистической значимости (коэффициенты корреляции равны 0,24 и 0,21 соответственно). Аналогичные тенденции, но ещё менее выраженные показали сывороточные концентрации ХС и b-ЛП со снижением/отсутствием роста бифидобактерий (r в пределах от 0,07 до 0,20). Кроме того, выявлена статистически значимая (r=0,33; p<0,05) прямая связь избыточного роста Esherihia Coli с уровнем общего ХС сыворотки крови. Схожая тенденция, но не достигшая степени статистически значимых значений была выявлена при избыточном росте этого микроорганизма с уровнем b-ЛП сыворотки крови (r=0,21), а также со значениями, превышающими общепринятые референтные интервалы для ХС (r=0,26) и b-ЛП (r=0,15) сыворотки крови. Достоверных связей между уровнями общего ХС и  b-ЛП сыворотки крови с ростом представителей условно-патогенной микрофлоры кишечника выявлено не было.

На втором этапе, после курса лечения споробактерином у пациентов с дисбактериозом III-IV степени его выраженность уменьшилась, соответственно до I (4 пациента), II (3 пациента) степеней. Из 8 пациентов с лёгкой степенью у троих были выявлены менее выраженные изменения в росте кишечной палочки, у одного сплошной рост кишечной палочки сменился незначительным его снижением, у четверых пациентов в контрольных анализах нормализация кишечной микрофлоры.

На фоне лечения статистически значимой динамики активности аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, щелочной фосфотазы, гамма-глутамилтранспептидазы и сывороточной концентрации билирубина не произошло.

Динамика липидных фракций на фоне лечения споробактерином представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Липидные фракций сыворотки крови при применении споробактерина.

Как видно из таблицы, наиболее статистически достоверной оказалась динамика уровня b-ЛП сыворотки (как и в случае взаимосвязи этих фракций с состоянием кишечной микробиоты). Уровень общего ХС также снижался статистически значимо, при этом концентрация ЛПВП осталась практически неизменной. Таким образом, зафиксированное снижение уровня общего ХС происходило именно за счёт атерогенных его фракций, что вкупе с неизменностью ЛПВП смещает соотношение в сторону последних.

Дискуссия и заключение. Полученные на первом этапе исследования результаты в целом подтверждают данные литературы об участии лактобактерий в регуляции липидного обмена. В то же время, достоверного подтверждения, полученным in vitro данным о роли в этом бифидобактерий не получено. Выявленные значимые связи повышения уровня ХС с избыточным ростом кишечной палочки могут быть предположительно связаны как с прямым действием этого представителя кишечной микрофлоры человека на липидный обмен, так и со сложными межвидовыми взаимодействиями различных представителей микробиоценоза кишечника.

В ходе оценки применения споробактерина пациентам с дисбактериозом кишечника обнаружилось не только его положительное действие на микрофлору, но и статистически значимое снижение уровня общего ХС (в среднем на 9,5%). Причём, снижение липидов происходило за счёт их атерогенных фракций, что свидетельствует также и о нормализации липидного спектра крови. Вероятной причиной динамики липидных фракций на фоне лечения споробактерином может быть как прямое действие Bacillis subtilis на всасывание и метаболизм жиров в кишечнике, так и опосредованное: путём подавления избыточного бактериального роста в тонкой кишке, а также  повышением уровня лактобактерий, гипохолестеринемический эффект которых подтверждён в достаточно большом количестве исследований (Tahri et al., 1996; Pereira D.I.A, McCartney A.L., Gibson G.R., 2003; Liong M.T., Shah N.P., 2005; Zhao J.R., Yang H., 2005; Dilmi-Bouras A., 2006). Кроме того, следует отметить, что при применении споробактерина достоверно отсутствовало свойственное для статинов (и описанное в инструкции по их применению) повышение активности аспарагиновой и аланиновой трансаминаз. Это открывает путь для дальнейших, более широких исследований в этом направлении и, возможно, включения споробактерина в комплекс гиполипидемической терапии.

Выводы.

• 1. Полученные данные свидетельствуют о возможном влиянии состояния микрофлоры кишечника на атерогенность липидных фракций крови.
• 2. Необходимы более масштабные исследования с длительным проспективным наблюдением для определения места препарата «Споробактерин жидкий, суспензия для приёма внутрь» в комплексной терапии атерогенных дислипидемий.

Библиография.

• 1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006 - 304 с.
• 2. Гланц С. Медико-биологическая статистика // М.: Практика. - 1999. - 460 с.
• 3. Грачёва Н.М, Гончарова Г.И., Аваков А.А. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника: метод. рекомендации. М., 1986, 28 с.
• 4. Есипов Д.В. Коррекция синдрома энтеральной недостаточности при острой кишечной непроходимости // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Оренбург. - 2004. - 27 с.
• 5. Исаев С.Ж. Профилактика хирургической инфекции у больных с открытыми переломами конечностей // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Оренбург. - 2005. - 26 с.
• 6. Киселёв С.А., Чичерин Д.С., Харитонов Д.В. Пребиотики: новая стратегия лечения дисбактериоза // Качество жизни. Медицина. - 2004. - №2 (5). - С. 70-71.
• 7. Кудашев С.Г. Экспериментальное обоснование нового способа профилактики хирургической инфекции огнестрельных ран // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Оренбург. - 2000. - 25 с.
• 8. Маянский А.Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т. 2, №2.
• 9. Никитенко В. И., Горбункова Н. Н., Жигайлов А. В. Споробактерин - новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов. //Дисбактериозы и эубиотики. Тез. докл. Российской научн.-практ. конф. 1996. С. 26.
• 10. Никитенко В. И., Никитенко И. К. Штамм бактерий Bacillus subtilis 534, используемый для получения препарата для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний. Патент на изобретение СССР № 1723116, 2 с. Опубл. 08.11.1986 г. в Бюлл. № 21.
• 11. Никитенко М.В. Новая форма препарата «споробактерин жидкий» и изучение её эффективности при лечении дисбактериозов кишечника // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Оренбург. - 2004. - 24 с.
• 12. Осипова И. Г., Сорокулова И. Б. Безопасность бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков //Ж. микробиол., эпидемиолог. и иммунобиол. 1998, № 6. С. 68-70.
• 13. Положенкова Л. А., Бурков С. Г., Бокерия О. А., Новиков С. В. Эффективность фловинила BS для лечения дисбактериоза кишечника //Клин. мед. 1999. Т. 77. № 2. С. 40-43.
• 14. Савельев В.С., Петухов В.А, Магомедов М.С. Липидный дистресс-синдром: руководство для врачей // М.: МАКС Пресс. - 2007. - 440 с.
• 15. Тараканов Б.В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных // Ветеринария. - 2000. - №1. - С.47-54.
• 16. Dilmi-Bouras A. Assimilation (in vitro) of cholesterol by yogurt bacteria // Ann. Agric. Environn. Med. - 2006. - №13 (1). - P. 49-53.
• 17. Endo T., Nakano M. Effects of a probiotic on the lipid metabolism of cocks fed on a cholesterol-enriched diet // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1999. - №63 (9). - Р. 1569-1575.
• 18. Fukushima K., Shindp K., Yamazaki R. et al. Jejunal bacterial flora and deconugation of bile acids// Int. J. Food Microbiol. - 1998. - Vol. 40, № 1-2. - P. 39-44.
• 19. Gilliland S.E.(1990) (цит. по Б.В. Тараканову: Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организма животных // Ветеринария. - 2000. - №1. - С.47-54.)
• 20. Grill J.P., Cayuela C., Antoine J.M., Schneider F. Effects of Lactobacillus amylovorus and Bifidobacterium breve on cholesterol // Lett. Appl. Microbiol. - 2000. - Vol.31, №2. - P. 154-156.
• 21. Grill J.P., Manginot-D