К.м.н. С.Г. Кудашев, М.В. Никитенко, В.Ф. Бородин, С.В. Никитин, Л.Д. Тырсин Оренбургский гарнизонный военный госпиталь, ММУЗ ГКБ №4 г. Оренбурга Журнал "Анналы травматологии и ортопедии", №2, 2001г.

Реферат

В статье описывается экспериментальное обоснование нового способа профилактики хирургической инфекции огнестрельных ран. В основе предложенного способа лежит использование живого бактериального препарата - споробактерина. В результате проведенных исследований выявлено, что споробактерин является более эффективным средством предупреждениях нагноения огнестрельных ран мягких тканей конечностей, чем антибиотик цефалоспоринового ряда цефамизин. Штамм Bac. subtilis 534, который представляет собой основу препарата, устойчив к воздействию высоких и низких температур, слабых растворов щелочей и кислот. Это создает потенциальные условия для создания очень стабильных форм препарата, необходимых для медицины катастроф.

Цель исследования.

Проблема профилактики хирургической инфекции в боевых условиях и при массовых катастрофах мирного времени является достаточно актуальной в наши дни. Ее актуальность обусловлена ростом числа гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей, открытых травм, достигающих 75-95% [И.Г. Лещенко, Н.Г. Головня, 1992]. В основе увеличения частоты гнойных осложнений огнестрельных ран, как считают П.Г. Брюсов, Н. А. Ефименко (1997) лежит комплекс факторов. В их числе неудовлетворительные гигиенические условия, неполноценное питание, фактор времени оказания помощи и особенности ранений, вызываемые современными видами оружия. Ввиду этого огнестрельные повреждения требуют особых способов предупреждения развития раневой инфекции. По военной доктрине на этапах медицинской эвакуации для предупреждения гнойных осложнений используются различные антибиотики, асептические повязки. В индивидуальной аптечке у военнослужащего имеются таблетированные тетрациклин с левомицетином. Накопленный клинический опыт и литературные данные свидетельствуют о недостаточной эффективности данных способов профилактики хирургической инфекции. Также при антибиотикотерапии наблюдаются аллергические, анафилактические реакции, развитие дисбактериозов, формируются полирезистентные микроорганизмы.

Для решения данной проблемы проводятся исследования в различных направлениях для изыскания новых более действенных препаратов. Так, В.И. Никитенко разработал живой бактериальный препарат споробактерин, рекомендованный МЗ РФ с 1992 года к использованию в клинической практике [1]. Основой препарата является живая культура сенной палочки штамма 534. Бактерии выделяют антибактериальное вещество широкого спектра действия, подавляют развитие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способствуют очищению послеоперационных ран, воспалительных очагов от некротизированных тканей. Бактериальная транслокация считается механизмом доставки микробов из желудочно-кишечного тракта в зону воспаления или повреждения [2, 6, 7, 8, 9]. До настоящего времени не имелось данных о профилактическом действии споробактерина при огнестрельных ранениях и других боевых механических повреждений.

Целью нашей работы являлась разработка нового способа профилактики хирургических инфекций при огнестрельных и неогнестрельных ранах, основанного на применении живого бактериального препарата.

Материалы и методы

Для сравнения эффективности профилактики хирургической инфекции у кроликов с огнестрельными ранениями мягких тканей конечностей при инъекционном введении цефамизина, местном орошении ран споробактерином и назначением споробактерина через рот был проведен эксперимент на животных. Также изучалась чувствительность штамма Bacillus subtilis 534 к термическим воздействиям, влиянию агрессивных химических веществ, микробный антагонизм в опытах in vitro и in vivo.

Под барбитуратовым наркозом 48 кроликам из малокалиберной винтовки были нанесены огнестрельные ранения в мягкие ткани задней конечности. Хирургическая обработка не проводилась, повязки на раны не накладывались. 12 кроликов контрольной группы лечение не получали. Другим 12 кроликам проводили профилактику хирургической инфекции путем внутримышечных инъекций цефамизина 2 раза в сутки (по 0,1 г на 1 кг веса животного). Двенадцати кроликам следующей группы споробактерин наносился на поверхности ран по 0,015 дозы по 2 раза в сутки. Оставшиеся 12 кроликов получали споробактерин через рот по 0,015 дозы по 2 раза в сутки.

За животными вели клинические наблюдения, которые включали: оценку общего состояния, измерения температуры тела, наибольшего диаметра воспалительных инфильтратов. Определяли количество гемоглобина по Сали, содержание эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева. Через одни, трое, пять и десять суток по три кролика из каждой группы выводили из опыта. У подопытных животных в области раневого канала были взяты ткани. После получения срезов и окрашивания гематоксилином Майера и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону, изучали гистологические проявления раневого процесса.

Результаты.

Клинически разница в течении раневого процесса при различных способах профилактики хирургической инфекции начала прослеживаться уже через сутки после травмы. У животных контрольной группы средний размер воспалительных инфильтратов был равен 2,53±0,13 см. При введении цефамизина и нанесении споробактерина на раны инфильтраты были значительно меньшими и соответственно составляли 1,75±0,11 и 1,62±0,07 см. У кроликов получавших споробактерин через рот средний диаметр воспалительного инфильтрата был равен 1,17±0,08 см. К третьему дню размеры инфильтратов увеличились в первых трех группах и составили соответственно 3,56±0,25 см, 3,26±0,14 см, 2,33±0,16 см. И только у кроликов получавших споробактерин через рот их размеры существенно не изменились - 1,41±0,08 см.

К десятым суткам в контрольной группе кроликов имелись раны с тканями темно-серого цвета со сливкообразным гноем и неприятным запахом (рисунок 1).

Рис. 1. Огнестрельная рана конечности кролика контрольной группы (10 сутки).

У всех кроликов, которым споробактерин наносили местно также имелись гнойные раны, хотя меньшего размера и малым количеством гнойного отделяемого (рисунок 2).

Рис. 2. Огнестрельная рана конечности кролика при местном применении споробактерина (10 сутки).

При лечении цефамизином в области ран отмечены гиперемия кожи, инфильтраты диаметром 4 - 7 см со струпами в центре. После рассечения ифильтратов обнаружены абсцессы содержащие сливкообразный гной (рисунок 3).

Рис. 3. Огнестрельная рана конечности кролика, получавшего инъекции цефамизина (10 сутки).

В то же время у животных, получавшие споробактерин через рот, раны зажили без возникновения хирургической инфекции (рисунок 4).

Рис. 4. Огнестрельная рана конечности кролика, получавшего споробактерин через рот (10 сутки).

Температура тела в первые сутки в среднем у кроликов повысилась на 1,3 - 1,7 градусов, по сравнению с температурой тела до нанесения ранения. На 3 сутки температура тела продолжала оставаться повышенной в контрольной, первой и второй опытных группах. В то же время у животных получавших споробактерин через рот она снизилась почти до нормы. На пятые и десятые сутки самая высокая температура тела была у кроликов, получавших инъекции цефамизина, что было связано с формированием абсцессов.

У кроликов всех 4 групп в первые сутки после ранения отмечено снижение в крови гемоглобина на 12-15%. До ранения его содержание колебалось от 65,9 до 66,3 г/л. К 3 суткам у всех животных количество гемоглобина в крови снизилось еще больше. В последующем мы наблюдали постепенное повышение его содержания, хотя и здесь наиболее выраженные положительные изменения регистрировались у кроликов с пероральным назначением споробактерина.

Сходная динамика была и в колебаниях содержания эритроцитов в крови. У кроликов до нанесения огнестрельной раны число эритроцитов колебалось в пределах 3,3 - 3,49х1012/л. Через сутки и трое их количество у всех животных уменьшалось. Стойкая тенденция к нормализации содержания эритроцитов в крови к 10 суткам отмечена у животных получавших споробактерин через рот, в то время как у кроликов других групп анемия продолжала регистрироваться.

У здоровых кроликов содержание лейкоцитов в крови было в пределах 9,1 - 9,25х109/л. Через сутки после ранения количество лейкоцитов у всех подопытных кроликов увеличилось на 5-8% (до ранения). К третьим суткам количество лейкоцитов продолжало увеличиваться: в контрольной группе на 19%; при введении цефамизина - на 10,%; при нанесении споробактерина на раны - на 11,0%. У кроликов получавших споробактерин через рот число лейкоцитов осталось практически прежним, увеличившись только на 3,8%. На 5 сутки лейкоцитоз по-прежнему сохранялся у животных контрольной, первой и второй опытных групп. К 10 суткам число лейкоцитов в крови у кроликов получавших споробактерин через рот нормализовалось, а у других животных оставалось повышенным. Наибольший лейкоцитоз регистрировался в группе кроликов, получавших инъекции цефамизина. Это было вызвано наличием закрытых полостей абсцессов.

При гистологическом исследовании обнаружено, что с помощью выстрела из малокалиберной винтовки у кроликов удалось получить огнестрельные раны мягких тканей с типичным строением. Прослеживались зоны раневого канала, контузии, молекулярного сотрясения. Через сутки отмечены явления умеренного посттравматического воспаления: полнокровие, кровоизлияние, некроз прилегающих тканей и серозно-фибринозная экссудация с примесью лейкоцитов.

Прекращались анаболические процессы и усиливались процессы катаболизма и денатурации белков. Подтверждением этому является эозинофилия клеток и ядер мышечных волокон. Погибающие волокна теряли контакты между собой и распадались, подвергались фагоцитозу, что подтверждается индексом фибробластов и количеством дегенерированных миосимпластов.

К 3 суткам воспалительные процессы в ранах и вокруг них становились более интенсивными, о чем свидетельствовали деструктивные изменения в мышечной ткани, дерме. В этот период начинается процесс формирования грануляционной ткани и образование зачатков микрососудов, что лучше проявлялось при введении споробактерина через рот (рисунок 3). При этом усиливалась стимуляция репродуктивной активности периваскуляторных клеток, численность макрофагов была на 30% выше, чем без применения споробактерина. Очевидно, что за счет макрофагов происходило повышение секреции монокинов, которые регулируют активность фибробластов, периваскулярных клеток и эндотелиоцитов, а также функционирование тканевых базофилов, лейкоцитов и лимфоцитов.

На 5 сутки отмечен рост грануляционной ткани, богатой сосудами. Между фибробластами выявлены коллагеновые волокна. Усиливалась репарация соединительной и скелетной мышечной тканей в ране, сосудов микроциркуляторного русла. Более всего это выражено у животных опытных групп, получавших споробактерин, особенно с введением его через рот. У последней группы кроликов индекс гибели фибробластов был в 2,5 раза ниже, чем в контрольной группе. Одновременно наблюдалось увеличение в 3 раза количества миосаттелитоцитов, образующих скопления, напоминающие примитивные миосимпласты и миотубулы.

К 10 суткам процессы фиброгенеза в ранах приводили к стягиванию их краев. В контрольной группе новообразующаяся соединительная ткань не имела таких выраженных признаков цитодиференцировки и коллагеногенеза. В этой группе, с введением цефамизина и споробактерина местно имелись признаки фибринозно-гнойного воспаления: по краю раны шло формирование лейкоцитарно-некротического процесса, который начинался в глубоких слоях и краевой зоны и распространялся к поверхности. К 10 суткам у кроликов получавших споробактерин через рот раны выполнялись грануляционной тканью с упорядоченным расположением коллагеновых волокон по периферии. Утолщенный многослойный плоский ороговевающий эпителий по краю раны наползал под струпом на грануляционную ткань в виде ободка шириной до 3 мм. Таким образом, к этому времени воспалительный процесс стихает, заканчивается формирование грануляционной ткани.

При исследовании чувствительности штамма Bac.subtilis 534 к термическим воздействия было обнаружено, что культура сохраняет жизнеспособность даже при кипячении в течение суток. Это связано с тем, что штамм сенной палочки 534 образует споры. Только при воздействии режимов стерилизации при температурах свыше 122 °С бактерии штамма погибают в течение 30 минут. Губительное действие на них оказывает стерилизация паром в течение 10 минут при 132 °С. Воздействие даже сверхнизких температур в течение 6 месяцев не приводит к потере жизнеспособности культур данного штамма.

При изучении влияния некоторых химических веществ на выживаемость 7- суточной культуры было обнаружено, что только высокая концентрация растворов соляной кислоты (6 и 12%) в течение 40 мин. убивает содержащиеся в культуре вегетативные формы и споры. Серная кислота этих же концентраций не действует на них. 12% раствор гидроокиси калия убивает культуры исследуемого штамма сенной палочки соответственно после часа экспозиции, а 3% формальдегид - только через 3 часа.

Бактерии Bac.subtilis 534 способны продуцировать ряд ферментов. Они выделяют каталазу, сахаролитические ферменты, способные расщеплять глюкозу и сахарозу. В то же время другие сахара (лактозу, маннит, ксилозу, мальтозу, дульцит) бактерии не разлагают. Амилолитическая активность штамма была выражена в гидролизе крахмала и образовании при этом глюкозы и сахарозы, на которые хорошо действуют сахаролитические ферменты. Еще более важной для клинической практики является протеиназная активность бактериальной взвеси, способствующая санации ран от некротизированных тканей. Протеолитические ферменты, выделяемые бактериями данного штамма, расщепляют различные белковые субстраты, как низкомолекулярные, так и с большой молекулярной массой. Протеиназная активность бактерий проявлялась разжижением желатина, активным разложением альбумина и казеина [4].

До настоящего времени из свойств оставался малоизученным антагонизм штамма Bac.subtilis 534 к микроорганизмам выделенным из ран. В частности, не исследовалась активность при хирургической инфекции огнестрельных ран. Нами было исследовано 143 штамма бактерий и грибков. Очень чувствительными (95% и более) к действию штамма Bac. subtilis 534, являющегося основой препарата споробактерина, оказались почти все основные возбудители хирургической инфекции как аэробы, так и анаэробы: стафилококки, стрептококки, протей, возбудители газовой гангрены, палочка столбняка. Следует отметить, что подавлялся рост всех 36 изученных штаммов золотистого стафилококка, а устойчивыми были сапрофитирующий и эпидермальный стафилококки. Важным для практики является наблюдение о высокой чувствительности возбудителей дизентерии (в 94%) к антибактериальным веществам, продуцируемым сенной палочкой. Последние часто осложняют эпидемиологическую обстановку в условиях боевых действий или при массовых катастрофах. Менее чувствительными к действию препарата споробактерина были кишечная палочка (75%), клебсиеллы (75%) и псевдомонады (60%). Штамм сенной палочки подавлял рост не только бактерий, но и всех шести исследованных штаммов грибков рода Candida [4]. Как известно, эти грибки не только могут осложнять течение нагноительного процесса, но и на фоне длительного применения антибиотиков вызывают распространенные кандидозы, поражая как желудочно-кишечный тракт, так и другие органы и ткани.

Обсуждение.

Таким образом, полученные результаты показывают, что живые бактерии Bacillus subtilis 534, вводимые в организм кроликов через рот оказались более эффективным средством профилактики нагноений, чем цефамизин. Развитие хирургической инфекции при нанесении споробактерина на раны объясняется тем, что высокая концентрация бактерий оставалась только на поверхности и не проникали вглубь тканей, где активную роль играли патогенные микроорганизмы. Напротив, вследствие феномена транслокации бактерии сенной палочки из желудочно-кишечного тракта с током крови и лимфы достигали и распространялись в области всего очага поражения.

Выводы.

В описанном эксперименте было получено подтверждение, что бактериальную транслокацию можно использовать с лечебной и профилактической целью. Наши материалы, по-видимому, могут служить базой проведения дальнейших исследований в клинике. Считаем, что они вполне могут быть использованы при создании простой в производстве и применении, стабильной формы препарата споробактерина, которую можно использовать как на догоспитальном, так и госпитальном этапах лечения. Исключение при этом антибиотиков, протеолитических ферментов снижает стоимость лечения и уменьшает дефицит лекарственных средств.

Список литературы

• Бактериальный препарат для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний. Европатент 0 363 491 В1. Дата приоритета -15.04.1988.
• Бердичевский Б.А. с соавт. Значение аутогенного инфицирования в развитии послеоперационных осложнений. Хирургия, 1993, № 5, с. 63-66.
• Брюсов П.Г., Ефименко Н.А. Итоги оказания хирургической помощи раненым и больным в военных лечебных учреждениях и предстоящие задачи. // Военно-медицинский журнал. - 1997. - № 7 - с.14-19.
• Кудашев С.Г. Экспериментальное обоснование нового способа профилактики хирургической инфекции огнестрельных ран. Автореф. дис. канд. мед. наук, Оренбург, 2000, 26 c.
• Лещенко И.Г., Головня. Огнестрельная рана и принципы её лечения. -Самара. - 1992. - с.58.
• Никитенко В.И, Бухарин О.В., Никитенко И.К. Явление естественного защитного бактериального механизма при повреждениях. Заявка на открытие № ОТ 11353, ВНИИГПЭ, 1986.
• Никитенко В.И. Взаимоотношения макроорганизма и бактерий в ране и тканях человека и животных. Хирургия, 1990, № 9, с. 94-99.
• Fu X.B. et al. Multiple organ injuries and failures caused by shock and reperfusion after gunshot wounds. J. Trauma, 1996, Mar., 40(3 Suppl), 135-139.
• Lemaire L.C. et al. Bacterial translocation in multiple organ failure: cause or epiphenomenon still unproven. Br. J. Surg. 1997, Oct., 84(10), 1340-1350.